Биохимические методы анализа

В последние годы IIIирокое применение находят биохимические методы исследования как при решении вопросов систематики рыб, так и при анализе ряда экологических вопросов (рост, созревание, периодика нереста и т. д.).

Электрофорез белков мышц и сыворотки крови. В целях систе щатики кинастоящему времени проведено много исследований по Дыявлению биологической специфичности белков различных видов рыб, причем в основном при помощи иммунологических и электрофоретических методов 1. Обзоры подобных исследований имеются в ряде сводок [Шульман, Куликова, 1966; Новиков, 1970; Кирпичников, 1973; Алтухов, 1974; Nyman, 1965, 1965 — 1966, 1966; Koehn, 1969; Cushing, 1970; Ridgway, 1971; и др.]. Многими авто рами показаны четкие различия состава белков у различных видов рыб, в частности на примере лососевых и сиговых [Кирсипуу. 1969; Остроумова, 1967; Новиков, Решетников, 1969; Ирискин, 1972, 1974; Жуков, 1974; Алтухов, 1974; Омельченко, 1975; Ша рипов, 1975; Vanstone, Chung Wai Ho, 1961; Bargetzi, 1958; Dril hon, Fine, 1963; Booke, 1964, 1968; Sanders, 1964; Nyman, 1965, 1967, 1972; Tsuyuki et al., 1966; Scagnetti, Parisi, 1967; Chellevold, 1970; Engel et al., 1970, 1971; Lindsey et al., 1970; Ferguson, 1974; Kothbauer, Schenkel-Brunner, 1975; и др.].
В частности, наши электрофоретические исследования белков сыворотки крови различных форм сига, семги, кумжи, севанской форели гегаркуни, арктического гольца и европейского хариуса показали, что для каждого вида характерно специфическое рас пределение белковых фракций [Новиков, Решетников, 1969; Peшетников, 1969, Reshetnikov, 1976].
Утрех исследованных популяцийї сигов Кольского полуострова II севанских сигов характер распределения белковых фракций II иих число в сыворотке крови было одинаковым. Различия отмечены лишь в процентном соотношении фракций. Так, у севанских сигов было меньше альбуминов (26 % вместо 40-46 % у северных форм) и а-глобулины преобладали над всеми другими фракциями.

Со ответственно этому соотношение альбуминов и глобулинов (А: Г) у севанских сигов было 0,31 — 0,44, а у северных популяций — 0,65-— 0,80.
Однако исследованиями многих авторов показано, что соотно шение белковых фракций в сыворотке крови зависит от способов хранения материала, условий опыта, физиологического состояния рыбы и ряда экологических факторов [Шульман, Куликова. 1966; Остроумова, 1967; Кирсипуу, 1969; Новиков, Решетников, 1969; Новиков, 1970; Решетников и др., 1970; иШатуновский, Но Виков, 1971; Ирискин, 1972; Booke, 1964; и др.].
В настоящее время общепризнано, что генетическая информа ция записана в виде специфических последовательностей пар азотистых оснований в структуре ДНК. У большинства высших организмов ДНК входит в состав нуклеопротеидов [Меттлер, Грегг, 1972]. Считается, что многие изменения (мутации) в поли пептидной цепи меняют заряд белковой молекулы и могут быть» уловлены при электрофоретическом анализе (обычно улавливает ся до 30—40% всех замен). Электрофорез в крахмальном и по лиакриламидном гелях позволяет фиксировать изменения биохи
1 Интересно упомянуть практическое применение метода электрофоре за мышечных белков при определении вида рыб в консервированных про дуктах для пресечения замены ценных видов рыб малоценными [Morel, 1974).

 
мического состава бегковых фракций. Совершенствование методов электрофоретического анализа позволило раздесяти, гомо- и гете
розиготных особей. Биохимическийї полиморфизм на уровне белков крови и тканей (гемоглобинов, трансферинов, гапитоглобинов, альбуминов, водно-растворимых ферментов и т. ин.) отмечен для многих видов рыб. Могие авторы отмечали полиморфизм белко вых фракцийї у лососевых и сиговых рыб [Vanstone, Chung \Wai Но, 1951: Drilhon, Fine, 1963; Booke, 190ј4; Sanders, 1964; Nyman, 1966, 1967, 1972; Tsuyuki et al., 1966; Chellеvоld, 1970; Clayton, Franzin, 1970; Lindsey et al., 1970; Engel et al., 1970, 1971; Clayton et al., 1973; Ferguson, 1974, 1975; Pethon, 1974; Ferguson et al., 1978].
Нг. примере сиговых рыб показано, что бели хрусталика гла тва могут слуякить хорошIII диагностическим признаком на уровне семейства, быстро двигающиеся фракциї сыворотких крови — на уровне рода, а медленные трансферины — на уровне вида и ноу Дяции [Chellеvоld 1970]. 11сипользование биохимических меток в виде маркеров генов используется при описании полиморфизма II у сиговых рыб.
В связJI с этим следует подчеркнуть точку зрения Р. Коена [Koehn, 1969), которыиї псалт, что хотя электрофоретически изо аллели могут быть различными в электрофоретическом поле, 10 физиологически опиї могут быть равнымиї, тем более что различия в электрофоретическоии подвижности белков свидетельствуют упрежде всего празном заряде и молекулярном весе белков, ию ико торым можно лишь косвенно суд??т, о структуре бетков. Не сте дует забывать и о тех непременных условиях, при соблюдении которых возможна лишь генетическая интерпретация электрофорефических белковых вариациї: 1) воспроизводство электрофоретических типов при анализе тех же особей, 2) таблюдаемые типы Должны соответствовать схеме простого мендетевского наследования, 3) сохранение типа в течение длительного периода онтогенеза, 4) распределение фенотипов должно соответствовать правилу Харди — Baiiнберга [Салменкова, Малинина, 1976 ]. В итоге не столь велика разница меду числом каберных тычII нок у сигов (тоже признак, которыиї контролируется генотипоми) и числом полос на электрофорегрaммe или колчеством энзимов их лактатдегидрогеназы --- все это признаки фенотипа, по которых можно лишь косвенно судить о генотине. В обом случае биохимические и генетические методы исследования долкны сочетаться
с анализом экологии изучаемой популяции.
Структуры РиК и ДНК. В последние годы все большее внима ние уделяется сравнению первичных структур РНК и ДНК как "Основных носителей наследственности. Это позволяет судить о структуре генома и строить систематику рыб по генетическому родству [Белозерский, 1969; Антонов, 1972; Медников и др., 1973, 1977; Попов и др., 1973; Медников, Антонов, 1974; Попов, Антонов, 1974; Медников, Ахундов, 1975; Mednikow et al., 1977]. Впервые для сиговых рыб это сделал Х. Бук [Booke, 1968), который

Таблица 7. Нуклеотидный состав некоторых представителей лососевидных рыб [по: Медников и др., 1973; Попов, Антонов, 1974]
(среднее значение и ошибка средней)

показал, что по сравнению с другими лососевыми рыбами сиговые имеют несколько иной нуклеотидный состав.
Методы, применяемые для анализа первичной структуры гео ма имеют разную разрешающую способность. Одним из методиче ских приемов анализа нуклеотидного состава является определение количественного содержания гуанин-цитозиновых пар (ГЦ-пар) нуклеотидов и степени метилированности цитозина (5-МЦ) вих ДНК [Попов, Антонов, 1974; Booke, 1968; Shigemitsu, Soichiro. 1976).
Среди костистых рыб лососеобразные отличаются высоким со держанием ГЦ-пар нуклеотидов и 5-метилцитозина (5-МЦ): в среднем лососеобразные имеют 45,5— 46,6 моль % и 1,7— 1,5 моль % 5-ЛиЦ при соотношении 5-МЦ к сумме ГЦ+5— МЦ порядка 6,6 8,5 (табл. 7). Анализ нуклеотидных последовательностей при по мощи кинетики реассоциации их ДНК позволил установить некоторые отличия строения ДНК у двух популяций чира р. Северная Сосьва [Амстиславский и др., 1976].
Больштей разрешающей способностью обладает метод молекулярной гибридизации ДНК-ДН? по Денхардту с последующим анализа
ализом термостабильности гибридных комплексов, что позволя с разделять не только разные виды, но и внутривидовые формы. та методика усовершенствована в Межфакультетской лаборато ки биоорганическоji xITмии имени А. Н. Белозерского МГУ. Совместно с сотрудникам Toji лаборатории мы проводили исследо ания сиговых рыб | Медицинков, Решетников, Шубина, 1977; Med nikov, Reshetnikov. Savvaitova, 1977).
Оставляя в стороне техническую сторону, которая подробно из пояжена в ряде статей [Теди иков и др., 1973, 1977; leиии Ков, Ан тонов, 1974; и др.], остановимся кратко на специфике :}того метода и его исто;10 чесКиЛ? постулатах. Метод молеку:3ярної гибридизации ДНК-ДНК позвоТяет судить о генетическом родстве изучаемых видов. Примается, что соrента дивергенцин форми (от предкового вида эволюция их геномов протекает независимо, без сглаживающего В.ТиЯНииЯ генетических рекомендаций, поэтому внук.100 тидной последовательности накапливаются различия. Посчитаю, что 10 нук,ТеоТиГдных замен вызывает снасите температуры плавления гибридныx дуплекс» 18 на 1,5°. Поэтому первым критерием степени ДивергенциUI (Пого вида от другого может быть снижение точки п.1 BTeиЯ Гибридных дуплексов ДНК.
Процент связывая меченой радиоактивым изотопом ДНК в термостабильные дуплексы 031ет стуть вторым Критерием близости вии,Дов или форм друг другу. 11, наконец, треть II м критерием родства может быт, сам характер, кривой стабильности гибридных молекут при нагреве.
Каждая серия опытов выно. Нялась не менее чем в двух повто рах. Случайные отопен IIя на кривых элюцивыравниваши мр тодом скользяцеїї среей. 11с.Позовали также обобщенный показате:Т», обозначены ii lai aiк ш; (екс ТивергенциII (ИД). равный сумме Вадратов от 1.Тошенний (d) прори.Я кривоїй элюциии исследуемоиї формы от реперной сигиданием «веса» в зависимост II от температуры ITAB.T? НиЯ (t) (fe IIIсков и ., 1977]. В общем виде форму.18 Имеет ни;{: 1Д - Erd* log . Температура ранжирована От 62 до 90° Kilik 1, 2, 3,... По точкам эюции. При этом мы исход1 ли из положения, что снижение температуры 11 авления гибрид ных молекул прямо пропорциона:1.10 Чосту ?11,1 ()TIIIIых за 3 , логарифм же температуры ирямо пропорционален време, про шедшему соста Ввергенц!!! сравниваемых форм. Результаты аназа изложены в г. у.
Лишедный обен, Успешно применяются бохимические мет(0) - ды и в экологических исследованиях. Изучение сезонных изменений биохимических показателей во многих случаях позволяет понять те тоulite pii 310.Тогическине перестроники, которые происхо ят в организмге зыб в связи с созреванием и ростом. В своих не жедованиях мы сочета. И электрофоретический анализ белков II Пидов сыворотки кровии санализом характера неиrропакоигнешня распределения липов по отдельных орга 11м. Использова. III иболее простые II доступиные Iя полевых сборов материала
53
методики: электрофорез на агаре [Грабар, Буртэн, 1963; Новиков, Решетников, 1969] и метод определения количества жира в а?, паратах Сокслета [Кривобок, Тарковская, 1957].
Проведенный анализ различных методов исследования сиговых рыб заставляет прежде всего подчеркнуть, что:
1) особое внимание должно быть уделено сбору добротной (у ? исходного материала, сбор данных должен проводиться по стаиl - дартным методикам или все отклонения от стандарта должны быть четко описаны, чтобы полученные результаты можно было сравнивать с ранее опубликованными;
2) выбранные методы исследования должны соответствоват, поставленным задачам, выводы не должны превышать разрешаю щую способность метода. В этом плане следует отметить многие работы, когда на основе весьма лабильных морфофизиологи ческих показателей пытаются судить о генетической разобщен - ности сравниваемых группировок;
3) современные методы математического анализа дают новые возможности в использовании той информации, которая заклю чеща в эмпирических данных; в этом плане использование совре менного арсенала математических методов и ЭВМ можно рассматривать как новый этап в развитии морфометрических иссле дований;
4) для изучения внутривидовой структуры сиговых рыб с успехом могут быть использованы меристические признаки, еслиї сборы охватывают рыб разного возраста и проводятся в течение ряда лет. Пластические признаки менее пригодны для этих целей, но при соблюдении ряда условий (учет возрастных и размерных изменений, характера аллометрии и т. п.), особенно в сочетании с современными методами математической обработки, также в ряде случаев могут давать неплохие результаты;
5) методы электрофореза сывороточных и мышечных белков, ферментов и энзимов еще не получили широкого распространения при исследовании внутривидовой структуры сиговых рыб. Боль шой разрешающей способностью обладает метод молекуляр ной гибридизации ДНК-ДНК с последующим анализом термоста бильности гибридных дуплексов, применение этого метода позво ляет судить о генетическом родстве исследуемых внутривидовых групп и отдельных видов сиговых рыб, а также о генетической близости сиговых сдругими группами лососевидных рыб,