4.4.2. Цитоморфологические особенности ППК у сига и гибридной формы при фенольной интоксикации

Токсические воздействия на ранних стадиях зародышевого развития сопровождаются патологическими изменениями половых желез у сеголеток, ведущими к их стерильности или уродствам потомства [Таликина и др., 1999, 2001 а]. При анализе контрольных и экспериментальных партий эмбрионов сига и гибридной формы были установлены различия в количестве и цитоморфологических состояниях первичных гоноцитов [Ефремова и др., 2011б].
61 сутки.

Сиг. Контрольная партия характеризовалась значительной вариабельностью количества ППК и их размеров (табл. 11 Приложения). Отмечали высокую долю полиморфноядерных клеток, встречались синцитии (рис. 20 а).
В единичных случаях выявляли многоядерные ППК. Количество ядрышек в среднем 2, реже достигало 4-х.
У эмбрионов в 1 варианте количество первичных гоноцитов снижалось почти вдвое по сравнению с контрольной партией, а размеры значительно варьировали. Соотношение числа первичных гоноцитов с округлыми и полиморфными ядрами оставалось на прежнем уровне, а доля синцитиальных комплексов резко сокращалась

 

Рис. 20. Первичные половые клетки у зародышей сига в контроле и эксперименте на 61 сут после оплодотворения
а — двухклеточный синцитий ППК (стрелка) у контрольной особи сига;
б — сегрегация ядрышек в ППК зародышей сига из 2 варианта (стрелка)

(табл. 11 Приложения). Количество ядрышек варьировало от 1 до 3. Во 2 варианте количество ППК несколько выше, чем в первом. Отмечали клетки с патоморфологическими изменениями ядрышек (рис. 20 б), выражавшиеся в увеличении их размеров и фрагментации. Такие изменения ядрышек чаще наблюдали в полиморфноядерных ППК (табл. 11 Приложения). Многоядерные клетки и синцитиальные образования выявлялись редко. Количество ядрышек варьировало от 1 до 5, в среднем 2–3.
Гибридная форма. В контрольной партии количество ППК значительно варьировало. Доля клеток с округлым ядром достаточно высока (рис. 21 а). Доля полиморфноядерных клеток и синцитиальных комплексов также высока. Количество ядрышек варьировало от 1 до 5, в среднем 2–3 (табл. 11 Приложения).
У эмбрионов 1 варианта количество ППК несколько возрастало, но вариабельность их числа сохранялась. Размеры увеличивались незначительно. Соотношение клеток разных состояний обычно не различалось с контролем. Многоядерная клетка была выявлена лишь у одного зародыша. Патоморфологические изменения ядрышек встречались и в клетках с округлым ядром, и в полиморфноядерных ППК (рис. 21 б). Число ППК во 2 варианте снижалось. Доля клеток с округлым ядром также сокращалась при одновременном возрастании доли полиморфноядерных ППК (табл. 11 Приложения). Однако отклонений в структуре ядрышек нами не было отмечено.
94 суток.
Сиг. У зародышей контрольной партии количество ППК сильно варьировало, а полиморфноядерные гоноциты, многоядерные (рис. 22 а) и синцитиальные образования встречались редко; они были выявлены лишь у одной особи с бóльшим числом клеток. Размеры ППК малы, в ядрах отмечены 2–4 ядрышка (рис. 22 б; табл. 12 Приложения).
В течение месяца после перевода зародышей 1 варианта из раствора фенола в чистую воду количество первичных гоноцитов у них увеличивалось и отличалось высокой количественной и размерной вариабельностью, выявлялись полиморфноядерные ППК с 1–2 ядрышками и группы синцитиев (рис. 22 в). Количество ядрышек совпадало с их числом в первичных гоноцитах контрольных особей; при этом обнаруживались клетки с морфологическими изменениями ядрышкового аппарата.
Во 2 варианте среднее количество первичных гоноцитов и их размеры изменялись в незначительной степени, а синцитии были отмечены почти у всех особей.

Рис. 21. Первичные половые клетки у зародышей гибрида в контроле и эксперименте на 61 сут после оплодотворения:
а – ППК (стрелка) во время миграции в область зачатка гонад у контрольной особи гибрида;
б – патоморфологические изменения ядрышек в полиморфноядерной ППК гибрида
из 1 варианта (стрелка)

Рис. 22. Первичные гоноциты у зародышей сига в контроле и эксперименте на 94 сут после оплодотворения:
а — двухъядерная ППК (стрелка) у контрольной особи;
б — ППК во время миграции (стрелка) в область зачатка гонад у контрольной особи;
в — в герминативном синцитии видны крупные ППК (стрелка) в 1 варианте;
г — сегрегация ядрышек в ППК зародышей из 2 варианта (стрелка);
д, е — в герминативных синцитиях появляются полиморфноядерные ППК;
часть синцитиев распадается, а гоноциты подвергаются деструкции (стрелка)
Число ядрышек несколько снижалось (табл. 12 Приложения), а в ядрах отдельных, одиночно лежащих ППК увеличивалось (рис. 22 г), что было вызвано фрагментацией ядрышкового аппарата. Синцитиальные образования включали и полиморфноядерные клетки (рис. 22 д), а у отдельных особей происходило распадение герминативных синцитиев и деструкция составляющих их ППК с превращением в клеточный детрит (рис. 22 е).
Гибридная форма. У контрольных эмбрионов число первичных половых клеток значительно варьировало (табл. 12 Приложения). При этом большинство ППК имело округлые ядра с 1–2 центрально расположенными ядрышками (рис. 23 а). Полиморфноядерные гоноциты выявлялись у отдельных особей, присутствовали синцитиальные образования.
У эмбрионов в 1 варианте при сходном с контролем числе и варьировании количества ППК несколько возрастало число синцитиев и полиморфноядерных гоноцитов (рис. 23 б). В остальном существенных различий с контрольной партией не было установлено (табл. 12 Приложения). Во 2 варианте количество ППК сокращалось, отмечали меньшее число синцитиальных образований, присутствовали клетки с отклонениями в структуре ядрышек. Нередко наблюдалась последовательность перехода ядрышек от обычного состояния к многолопастной конфигурации (рис. 23 в, г) с последующим пикнозом (рис. 23 д) и начальными фазами дезинтеграции (рис. 23 е), что отражает специфический ответ ядрышка на экстремальные воздействия [Зацепина, 2009]. Соответственно изменялось соотношение ППК разных состояний (табл. 12 Приложения).
Подводя итоги выявленной реакции формирующейся репродуктивной системы эмбрионов сига и его гибрида на воздействие разных доз фенола, выделим некоторые важные моменты. В первую очередь отметим прямую связь увеличения числа, размеров и темпа формирования первичных половых клеток у зародышей сига с концентрацией токсиканта. Можно заметить, что после месячной экспозиции сначала в среде с фенолом, а затем в чистой воде интоксикация не оказывала существенного влияния на формирование линии половых клеток. Дальнейшее же развитие зародышей при тех же концентрациях истощает ресурсы организма и ведет к поражению их репродуктивной системы, как это отчетливо показано у части особей.
В обеих опытных партиях сига и гибрида просматривалось изменение соотношения разных состояний первичных гоноцитов, видоспецифичность которых проявлялась при хроническом воздействии фенола. У зародышей сига в растворе фенола 0,02 мг/л в некоторых синцитиальных образованиях были отмечены дегенерирующие ППК, а сами синцитии распадались на отдельные клетки. У гибрида отклонения проявлялись в некотором снижении цитометрических показателей половых клеток, что было отчетливо заметно по состоянию ядрышкового аппарата.
Рассмотрим реакцию ядрышка — самой крупной структуры ядра — на интоксикацию в контексте его биологической роли. Генам ядрышкового организатора отводится ведущее место в формировании рибосом. В ряде исследований показано, что нарушения рибосомальных генов приводят к нарушениям в гонадогенезе. Поскольку ядрышко является сенсором многих стрессовых воздействий на клетки, его разрушение или повреждение приводит к стабилизации основного регуляторного белка апоптоза (р53), вызывающего гибель клеток [Зацепина, 2009]. Автор отмечала, что частичное или полное ингибирование транскрипции рДНК приводит к уменьшению размеров ядрышка и сегрегации его основных структурных компонентов, включая фибриллярные центры — «депо» неактивных рибосомных генов и РНК- полимеразы I, плотного фибриллярного компонента (зона созревания пре-рРНК) и гранулярного компартмента, служащего местом формирования рибосомных частиц. А ингибирование киназ, фосфорилирующих основные ядрышковые белки (В23/нуклеофозмин, нуклеолин, UBF и др.), сопровожда58
ется характерным «разворачиванием» ядрышек и происходит преимущественно в клетках, находящихся в состоянии репликации ДНК. В результате этих воздействий наблюдается гибель клеток путем апоптоза.

Рис. 23. ППК и состояние ядрышек у зародышей гибридной формы контрольной и опытных партий на 94 сут после оплодотворения:
а — первичная половая клетка (стрелка) контрольной особи во время
миграции в область половых гребней;
б — полиморфноядерная ППК (стрелка) под Вольфовым протоком зародыша из 1 варианта;
в, г — многолопастные ядрышки (стрелки) в ядрах ППК зародышей из 2 варианта;
д, е — пикноз и дезинтеграция ядрышек (стрелки), конденсированный хроматин
распределен по периферии ядра
Изучая экспрессию рибосомального белка RpL10A у данио, исследователи [Makkapan et al., 2014] установили его роль в регуляции развития половых желез рыб. Так, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени, измеряя интенсивность экспрессии белка в тканях гонад после инкубации с экстрактом гипофиза форели и различных половых стероидов было показано, что 11-кетостерон (100 нг/мл) эффективно повышает экспрессию RpL10A в тестикулярной ткани, в то время как 17β-эстрадиол его экспрессию в ткани яичников снижает.
Исследовалось также влияние токсикантов на ранний гаметогенез сиговых и других видов рыб. Нами показано [Беспоместных, 2007], что при воздействии фенола (0,05 мг/л) на личинок сиговых рыб количество ППК у них изменялось в широком диапазоне; если у пеляди их число снижалось, то у пыжьяна, муксуна и чира фенол достоверного влияния на этот показатель не оказывал. Выявленный нами эффект стимуляции формирования ППК у зародышей сига при фенольной интоксикации согласуется с вышеупомянутыми данными, полученными на плотве [Таликина и др., 1999].
Эти результаты, как и наш эксперимент, отчетливо продемонстрировали классическую триаду общего адаптационного синдрома (ОАС) Г. Селье [1960].
Нарушения ядрышкового аппарата ППК у сига и гибридной формы и деструктивные изменения самих клеток, выявленные нами на уровне светового микроскопа, при более тонких методах исследования могут быть обнаружены значительно раньше и при меньших концентрациях токсикантов. Так, под влиянием кадмия и фенола установлены нарушения ультраструктуры ППК в эмбриональный период морских ежей [Реунов и др., 2005]. Исследователями показано, что содержание токсикантов, даже намного ниже ПДК (для фенола — 0,001 мг/л, для кадмия — 0,005 мг/л), оказывает комплексное повреждающее воздействие на ультраструктуру их половых клеток. Этими и другими авторами было установлено разрушение половых детерминантов в сперматогониях и «стерилизация» половых клеток, а также признаки дисфункции вспомогательных клеток при общем снижении репродуктивной способности организма [Реунов и др., 2005; Au et al., 2001; 2003].
Таким образом, хроническое влияние фенола на зародышевое развитие рыб и беспозвоночных гидробионтов оказывает угнетающее воздействие на морфогенез, а кратковременная пролиферативная активность первичных гоноцитов на последующих этапах онтогенеза сопровождается нарушением их структуры и подавлением репродуктивной системы.
Показанное позволяет резюмировать, что у зародышей сиговых рыб, попавших в условия даже незначительного повышения содержания фенола в воде нерестилищ и более-менее продолжительное время находящихся в этих условиях, даже при последующем продолжительном освежении воды восстановления пораженных функциональных систем не произойдет. Если даже эмбриогенез завершится вылуплением и молодь попадет в благоприятные условия нагула, отклонения в репродуктивной системе рано или поздно приведут к ее дегенерации, что показано и в опытах даже с более токсикорезистентными видами — карповыми [Таликина и др., 1999, 2001а].