4.5. Метод бокового микроскопирования для изучения живой икры
Для исследования икры и отслеживания особенностей эмбрионального развития рыб,
в стенах Байкальской лимнологической станции Восточно-Сибирского Отделения АН
СССР (ныне Лимнологический институт Сибирского Отделения РАН), был разработан
метод вертикальной камеры, совмещённой с боковым микроскопированием (Черняев,
1962). Этот способ исследования признан многими эмбриологами и, в частности, на ка-
федре ихтиологии Биологического факультета Московского государственного универси-
тета и за рубежом (Balon, 1985).
Для наблюдения и контроля за развитием икры на сиговых рыбоводных заводах
пользуются тремя оптическими устройствами: микроскопами, бинокулярными стере-
оскопическими микроскопами и препаровальными лупами. Как правило, применяемые
микроскопы типов МБД, МБИ, МБР дают достаточно сильное увеличение для наблюде-
ния за спермой. Однако для рассмотрения икры имеющиеся на них объективы слишком
большое увеличение. Икру сиговых рыб удобно исследовать с помощью геологического
микроскопа. Объектив этого микроскопа с увеличением ?4,7 обладает достаточно боль-
шим полем обзора для рассмотрения одной икринки диаметром около 3 мм. При этом
получается не прямое изображение, а перевернутое.
Стереоскопические микроскопы марок МБС?1 и МБС?2 имеют достаточную разре-
шающую способность для исследования икры сиговых и дают прямое изображение на
всех этапах развития. Наиболее удобен стереоскопический микроскоп МБС?1, так как его
можно легко переносить с одного рабочего места на другое. Обычные препаровальные
лупы, которые дают небольшое увеличение, применяются при массовых промерах и про-
счетах икры и личинок.
Долгое время эмбриологические исследования рыб проводились преимущественно
на фиксированном материале и при помощи микросрезов. Изучались процессы форми-
рования зародыша, его микроскопическое строение, а внутренняя структура, особенно
кровеносная система, из-за свертывания и помутнения белка оставалась невидимой. По-
ведение зародыша наблюдать было практически невозможно.
Основателем морфоэкологического направления в эмбриологии рыб С. Г. Крыжанов-
ским и его учениками была разработана методика наблюдения и зарисовки живой разви-
вающейся икры. Икру помещали в сферическую кювету или на часовое стекло и рассма-
тривали под микроскопом, обычно, при слабом увеличении объектива (х 8 для мелкой
икры, ?3,7 — для более крупной, ?1 — для очень крупной). Плазменные и клеточные
структуры живой икры сиговых рыб в отличие от фиксированной прозрачны, благодаря
чему можно рассматривать всю её толщу. Если эмбрионы подвижны, на них воздейству-
ют наркотическими средствами — уретаном, хлорэтаном, спиртом (для осетровых), раз-
веденным водой до 0,5%-ной концентрации, прибавляя их по каплям.
При исследовании развития икры байкальского омуля, сига и чёрного байкальского
хариуса (Черняев, 1968, 1973, 2001) был успешно применён способ бокового микроско-
пирования, который основан на свойстве икринок ориентироваться анимальным полю-
сом вверх. При этом способе микроскопирования клеточные и анатомические структуры
зародыша не накладываются на светопоглощающие включения яйца (меланофоры и эри-
тробласты) и интенсивно окрашенные каротиноидными пигментами жировые капли
и белково-каротиноидными комплексами желтка. Это позволяет обнаружить структуры
зародыша, невидимые при обычном микроскопировании.
Достаточно крупная (2–5 мм) икра сигов содержит много каротиноидов, которые
придают ей окраску от бледно-жёлтой до ярко-оранжевой в зависимости от вида рыбы,
диаметра икринки и состава пигментов. Интенсивнее всего окрашены жировые капли, ко-
торые, подстилая на анимальном полюсе развивающийся зародыш, выполняют гидроста-
тическую функцию. Вследствие этого зародыш постоянно занимает верхнее положение
головным отделом внутри яйцевой оболочки, т. е. находится в наиболее обширной части
перивителлинового пространства. При рассмотрении икры со стороны анимального по-
люса свет, идущий от конденсатора микроскопа, в значительной степени поглощается
в толще окрашенной икринки. Из-за прозрачности тканей зародыша, который располо-
жен над интенсивно окрашенными жировыми каплями, наблюдать и зарисовывать его
строение при классическом положении микроскопа очень трудно.
Для рассмотрения икры сбоку микроскоп горизонтально закрепляют в специальной
подставке, в результате чего оптическая ось объектива занимает горизонтальное поло-
жение. Предметный столик располагается вертикально. Наклонный тубус, повернутый
в сторону наблюдателя, сохраняет обычное положение под углом 45° (рис. 42).
Для микроскопирования икру помещают в камеру из органического стекла, которая
изготовляется следующим образом. На пластинку оргстекла размером с обычное предмет-
ное стекло (75?25 мм) дихлорэтаном, хлороформом или уксусной кислотой приклеивают
другую пластинку размером немного больше покровного стекла и толщиной, несколько
превышающей диаметр исследуемой икры (около 3 мм для сигов и омуля). В центре ее про-
сверливают отверстие диаметром 16 мм — немного меньше размера покровного стекла.
В это отверстие вносят пипеткой несколько (около 20) живых икринок, камеру заполняют
водой и покрывают покровным стеклом так, чтобы в ней не оставалось воздуха (рис. 43). За
счет поверхностного натяжения покровное стекло своими краями плотно примыкает к кор-
пусу камеры, которую зажимают в клеммы предметного столика микроскопа. Зародыши
92
за счёт собственных гидростатических свойств поворачиваются в поле зрения микроскопа
анимальным полюсом вверх и становятся доступными для рассмотрения сбоку.
На рис. 44, а изображена икринка омуля на стадии бластулы так, как она видна
в обычный микроскоп. Бластодиск, образованный очень мелкими клетками, почти не-
заметен. Жировые капли, интенсивно окрашенные каротиноидами в ярко-оранжевый
цвет, собраны под бластодиском и сильно поглощают свет. (Сам желточный мешок также
окрашен в оранжевый цвет и при таком увеличении кажется желтым). Бластоцель только
угадывается по граничащему с ним сгущению клеток в области краевого узелка, оболочка
яйца при таком обозрении икринки равно удалена от желточного мешка. Все это крайне
затрудняет наблюдение за икрой, особенно на ранних стадиях развития.
Рис. 42. Установка микроскопа при боковом микроскопировании (по Черняев, 1962).1 — тубусо-
держатель микроскопа; 2 — рисовальный аппарат; 3 — вертикальная камера; 4 — тубус окуляра;
5 — объективы; 6 — подставка-держатель микроскопа; 7 — рисовальный столик
Рис. 43. Вертикальная камера (вид сверху и сбоку):
1 — несущая пластинка; 2 — корпус; 3 — покровное стекло 4 — икра
На рис. 44, б изображена та же икринка, обозреваемая сбоку. Бластодиск четко выде-
ляется на фоне перивителлиновой полости: в нем ясно заметны бластоцель и сгущение
клеток краевого узелка. Жировые капли собраны под бластодиском. При таком способе
обозрения икринки клеточные структуры не заслоняются жировыми каплями и хорошо
видны; таким образом, наблюдатель имеет более полное представление о положении за-
родыша и желточного мешка внутри оболочки относительно субстрата.
Описанный способ позволяет наблюдать за развитием икры, точно определять стадии
развития, особенно ранние, не прибегая к фиксации зародыша, и делать детальные рисун-
ки с помощью рисовального аппарата и рисовального столика, наклонённого к исследо-
вателю под углом 45°. Возможность просматривать сразу массовый материал позволяет
вести наблюдение за развитием икры на рыбоводных заводах, устанавливать степень её
оплодотворения и определять стадии развития (что очень важно для избежания потерь
икры при перевозке на чувствительных к механическому воздействию стадиях разви-
тия — после бластулы и до замыкания желточной пробки).
Для зарисовки икры и эмбрионов применяется складной рисовальный столик (рис. 45)
размером 36?24 см, сделанный из многослойной фанеры толщиной 10 мм. В опорной пло-
скости рисовального столика прорезано отверстие размером 18,5?12 см, в которое при сло-
жении столика вкладывается упорная планка, удерживающая рисовальный столик (верх-
нюю его поверхность) в рабочем положении под углом 45° к плоскости рабочего стола.
По краям отверстия опорной плоскости рисовального столика имеются пазы, а в даль-
нем конце упорной планки ввернуты штифты для удержания ее в рабочем положении.
В полевых условиях подставка для микроскопа изготовляется путем пропиливания в тол-
стом куске дерева паза под тубусодержатель, который фиксируется любыми щепками
в виде клиньев.
А. Р. Рубенян (1976) предложил использовать в качестве микроскопа бинокулярную
лупу МБС?1 или МБС?2, закрепив ее основание в вертикальном положении путем вдавли-
вания в пенопласт и обеспечив тем самым горизонтальное микроскопирование.
Вертикальная камера для рассмотрения икры крепится к световому люку предметного
столика микроскопа. Этот способ значительно облегчает и упрощает микроскопирование
развивающейся икры и позволяет быстро определить процент оплодотворения.
Рис. 44. Икра омуля при различных способах микроскопирования:
а — боковом, б — обычном (вертикальном)
Обозначения: о — оболочка; бд — бластодиск;
бц — бластоцель; ку — краевой узелок;
ж — желток; жк — жировые капли
Рис. 45. Складной рисовальный столик:
Рис. 46. Бинокулярная лупа МБС –1 с вертикальной камерой, модернизация А. Р. Рубеняна. 1.
Световой люк предметного столика. 2. Объектив микроскопа. 3. Тубусы с окулярами. 4. Клеммы для
удержания камеры в вертикальном положении. 5. Осветительное устройство.