4.3. Ранний онтогенез рыб в условиях интоксикации среды

В водной токсикологии понятие «чувствительность» обычно рассматривают в качестве обратного — «устойчивости». Чувствительными считаются организмы, погибающие при относительно более низких концентрациях вещества. Организмы, выживающие при более высоких концентрациях этого же соединения, относятся к более устойчивым (резистентным).

Следует отметить также, что экотоксикологические исследования в основном проводятся на взрослых гидробионтах. Однако наиболее чувствительными компонентами ихтиоценозов к действию неблагоприятных факторов являются ранние стадии онтогенеза — эмбрионы, личинки и мальки. Это вызвано не полностью сформированными защитными и детоксикационными механизмами к воздействию экстремальных факторов [Данильченко, 1977; McIntosch et al., 2010]. Известно, что зародыши разных видов рыб характеризуются различной степенью чувствительности к различным токсикантам и в зависимости от природы вещества и его концентрации развиваются лишь до определенных стадий эмбриогенеза: начало образования бластодиска, бластула, завершение эпиболии и т.д. [Nguyen et al., 1999; Bourrachot et al., 2008; Foekema et al., 2008]. В ряде случаев патологии могут проявиться только у личинок или ко времени их перехода к мальковому этапу [Данильченко, Строганов, 1975; Таликина и др., 1999].

В экспериментах по воздействию оловоорганических соединений, салицилаланилидов и др. токсикантов на эмбрионов и ранних предличинок окуня Perca fluviatilis, ерша Acerina cernua, вьюна Misgurnus fossilis, русского осетра Acipenser gueldenstaedtii, севрюги A. stellatus и шипа A. nudiventris [Данильченко, 1977] было установлено, что чем раньше эмбрион начинает испытывать действие токсиканта, тем глубже происходящие с ним изменения. Икра рыб наиболее чувствительна в момент оплодотворения и во время дробления. Высокая чувствительность в этот период объясняется ранней биохимической дифференцировкой, проходящей еще до возникновения видимых морфологических различий. Однако детерминированные структуры менее подвержены действию внешних факторов, поэтому в ходе дальнейшего эмбриогенеза чувствительность уменьшается. Она вновь резко возрастает к моменту вылупления предличинок. Так, у вьюна икра в момент оплодотворения и в начале развития в 100–500 раз более устойчива к действию токсикантов, чем предличинки и личинки. В еще более высокой степени снижается устойчивость осетровых рыб; резистентность их икры в 104 раз больше, чем у личинок, а по отношению к растворам трипропилоловохлорид (ТПОХ) — в 106 раз [Данильченко, 1977].
В экспериментах с эмбрионами кижуча и предличинками кижуча и кеты [Петухов, Сторожук, 1980] было установлено ингибирующее действие ртути при концентрации 1 мкг/л на содержание микроэлементов в их организме. Токсическое действие тяжелых металлов (Hg, Pb, Cd) обусловлено высокой степенью сродства к SH-группам в белковых молекулах, где они блокируют образование дисульфидных связей. Кроме того, высокотоксичные тяжелые металлы вытесняют из металлосодержащих ферментов простетическую группу, в результате чего фермент теряет свою активность.
В эксперименте с эмбрионами вьюна [Костров, Шеханова, 1981] установлено снижение уровня общего обмена под влиянием хлорида ртути и сочетанном действии хлорида ртути и 32P, начиная со стадии поздней гаструлы до вылупления.
В цикле работ М.Г. Таликиной с соавторами [1999, 2000, 2001а, б, 2003] на плотве было исследовано состояние репродуктивной и других систем у сеголеток, подвергшихся воздействию различных токсикантов на стадии икры, в период эмбриогенеза или после вылупления, а также после интоксикации спермы. Так, пребывание эмбрионов плотвы в растворах хлорофоса (0,0001, 0,001 и 0,01 мг/л) и фенола (15 и 30 мг/л) от осеменения до завершения эмбриогенеза показало, что наиболее губительны для зародышевого периода высокие концентрации фенола [Таликина и др., 1999]. Дальнейшие исследования 4-месячных сеголеток выявили отдаленные последствия интоксикации в период эмбриогенеза в виде снижения линейно-весового роста и гистопатологических изменений гонад. Аналогичные результаты были получены в экспериментах с карпом и окунем [Таликина, Комов, 2003].
Поскольку эмбрионы в зародышевых оболочках обладают относительно высокой устойчивостью к токсикантам, было предпринято исследование характера и степени поражения органов у зародышей плотвы хлорофосом, фенолом и бытовыми стоками с высоким содержанием аммиака и азотистых соединений при завершении эмбриогенеза и у предличинок [Таликина и др., 2000]. Авторы отмечали, что дозозависимый кумулятивный эффект этих токсикантов в конце эмбрионального развития сильнее проявляется в последующие периоды. Он наиболее значителен при фенольной интоксикации 20 и 15 мг/л (выживаемость около 20 %), в меньшей степени при воздействии 0,01 мг/л хлорофоса (выживаемость более 40 %). При воздействии на предличинок установлен пролонгированный эффект в виде поражения структуры семенников почти у половины сеголеток, а у трети самок отклонения проявлялись в виде замедления развития яичников.
В серии экспериментов с эмбрионами и личинками плотвы [Таликина и др., 2001а] было установлено, что при действии на них хлорофоса и фенола в семенниках сеголеток выявлялись различные нарушения митозов: диминуция хромосом в цитоплазму и рассеивание в метафазе, отставание хромосом при расхождении к полюсам, хромосомные мосты в поздней анафазе и ранней телофазе; реже обнаруживались многополюсные митозы и трехгрупповые метафазы.
Авторы особенно подчеркивали, что у рыб, по сравнению с теплокровными позвоночными, полного восстановления цитогенетической нормы в аберрантных клетках не происходит. При действии токсикантов на предличинок впоследствии, уже у сеголеток в возрасте 4 мес, установлены такие нарушения гаметогенеза, как анатомические признаки интерсексуальности, разрастание соединительнотканных элементов, появление в яичниках двухъядерных превителлогенных ооцитов. Общее число самок с гистопатологией гонад после токсических воздействий на икру, предличинок и личинок составляло соответственно 25, 28 и 18 %.
Нарушения сперматогенеза проявлялись в разрастании стромы гонады, появлении сперматогониев с двумя и более ядрами; в некоторых семенниках присутствовали дегенерирующие превителлогенные ооциты. Общее число самцов с цитоморфологическими отклонениями гонад после токсических воздействий на икру, предличинок и личинок составляло соответственно 22, 21 и 14 %. Подчеркивалось, что наибольший повреждающий эффект на ранние этапы формирования гонад у сеголеток плотвы обоего пола отмечен при действии сточной воды и фенола на только что вылупившихся предличинок.
Установить характер нарушений в развитии сеголеток плотвы после обработки токсикантами зрелых спермиев в период оплодотворения, составляло цель последующих исследований [Таликина и др., 2001б]. Было показано, что повреждающее воздействие после кратковременной обработки спермы сублетальными дозами мутагена нитрозогуанидин (MNNG) и органических ядов (хлорофос, фенол и ароклор 1254) начинало проявляться при переходе личинок к внешнему питанию и усиливалось в ходе дальнейшего развития в клетках генеративной и соматической тканей. Отдаленные последствия этого влияния на зрелые спермии, наиболее отчетливо выразившиеся в увеличении цитогенетических аномалий в сперматогониях и эритроцитах периферической крови, могут отражать определенный уровень дестабилизации генома молоди плотвы.
В ходе проведенной кратковременной обработки спермы плотвы у 4-месячного потомства пониженный уровень стабильности гонадогенеза отмечен у 64,6 % особей; наиболее существенное отставание в росте и развитии выявлено в вариантах обработки спермиев меньшими концентрациями мутагена MNNG и хлорофоса [Таликина и др., 2003]. Эти отклонения проявлялись в повышенном уровне хромосомных аберраций в делящихся сперматогониях и в эритроцитах периферической крови, гистопатологии гепатоцитов, торможении гаметогенеза, повышенной асимметрии гонад и в угнетении линейно-весового роста.
Данные, сходные с приведенными результатами, были получены при изучении влияния сырой нефти на эмбрионы и молодь атлантической сельди Clupea harengus [McIntosch et al., 2010]. Авторы установили отрицательную корреляцию между возрастом эмбрионов и токсичностью диспергированной в воде сырой нефти при 144- часовой экспозиции. Наибольшей чувствительностью отличались эмбрионы сразу после оплодотворения. При воздействии нефти на предличинок сразу после выхода из икры у них развивались некрозы, а действие токсиканта на гаметы вело к резкому снижению оплодотворяемости икры.
В последние годы воздействие токсикантов часто исследуется на биохимическом и генетическом уровнях.
Модифицирующее действие загрязнения на белковый состав может быть следствием как генетических вариаций, так и постсинтетических модификаций белков, обусловленных их комплексированием с ксенобиотиками и метаболитами. Значительная гетерогенность белков суммарных экстрактов личинок из загрязнённых акваторий связана, как предполагается, с большей вариабельностью фракционного состава, что также может быть следствием влияния избыточных концентраций токсикантов [Руднева, Залевская, 2004].
Для выявления механизма реакции на воздействие токсикантов И.И. Руднева с соавторами [2003] провела исследования с личинками атерины Atherina hepsetus в среде с полихлорированными бифенилами (ПХБ). Авторами показано, что наиболее чувствительным биомаркёром интоксикации (0,1 нг/л) является уровень теплопродукции; при возрастании концентрации токсиканта снижаются электрофоретическая подвижность и фракционный состав белков, а при повышении концентрации ПХБ в воде до 50 нг/л активизируются ферменты антиоксидантной системы — каталаза и глутатионредуктаза. Было также отмечено, что снижение теплопродукции у эмбрионов бычка-кругляка Neogobius melanostomus и задержка вылупления личинок происходит при концентрации ПХБ 1 нг/л.
В ходе экспериментов [Руднева и др., 2000; Чесалина и др., 2000] по влиянию мазута и соляра на активность ферментов, перекисное окисление липидов, энергетический обмен молоди черноморской кефали Liza saliens было показано, что ответные реакции на действие токсикантов зависят от этапа развития, типа токсиканта, его концентрации и времени воздействия. Установлено, что наиболее выраженная реакция среди антиоксидантных ферментов характерна для супероксиддисмутазы (СОД). А у личинок атерины активность антиоксидантных ферментов коррелирует с уровнем антропогенной нагрузки [Руднева, Залевская, 2004].
Исследование хронического воздействия перфтороктансульфоната (ПФОС) на эмбрионы данио рерио [Shi, Zhou, 2010] показало, что данный ксенобиотик в концентрации 1 мг/л стимулировал продукцию активных форм кислорода и повышение активности ферментов антиоксидантной защиты — супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы. ПФОС индуцировал апоптоз эмбриональных клеток, а активатор генов ядерного фактора Nrf2 сульфорафон препятствовал продукции активных форм кислорода. Как следствие, сопряженный с Nrf2 сигнальный каскад играет защитную роль при индукции у эмбрионов рыб окислительного стресса, вызываемого ПФОС.
Актуальны также исследования влияния важнейших промышленных токсикантов — кадмия и фенола, на тонкие механизмы развития половых клеток морских ежей. Было показано, что содержание токсикантов, даже намного ниже ПДК, оказывает комплексное повреждающее воздействие на ультраструктуру половых клеток морских ежей. В исследованиях обнаружено разрушение половых детерминантов в сперматогониях и «стерилизация» половых клеток, признаки дисфункции вспомогательных клеток при общем снижении репродуктивной способности организма [Аu et al., 2001, 2003; Реунов и др., 2005]. Как установлено в экспериментах с эмбрионами трансгенных линий медаки Oryzias latipes [Аizawa et al., 2007], гамма излучение снижает у них количество ППК, но не оказывает влияния на вылупление. Повышенная радиочувствительность первичных гоноцитов эмбрионов проявляется на 32–33 стадиях, во время возрастания их пролиферативной активности; ППК будущих самок менее устойчивы по сравнению с ППК самцов.
Таким образом, рыбы наиболее чувствительны к воздействию ксенобиотиков в эмбриональный и ранний личиночный периоды развития, по причине слабой сформированности механизмов детоксикации. При этом их реакции на интоксикацию видоспецифичны, а степень поражения зависит от природы токсиканта, продолжительности экспозиции и стадии онтогенеза. Отмечен пролонгированный характер интоксикации, в наибольшей степени проявляющийся в различных цитогенетических нарушениях, интерсексуальности, дегенерации репродуктивной системы.