Изменения в гаметогенезе и половом созревании молоди муксуна (Coregonus muksun) при воздействии сурфагона.

Муксун (Coregonus muksun) является одним из самых ценных видов среди си-
говых рыб, в то же время численность его популяций в Западной Сибири в
последние десятилетия устойчиво сокращаются, что в перспективе может по-
ставить этот вид на грань исчезновения [12]. Коммерческая ценность муксуна
определяет высокую промысловую нагрузку на этот вид, в том числе и брако-
ньерский промысел, в то же время искусственное воспроизводство, способное
восстановить численность обской популяции, является ресурсозатратным.

Поздние сроки полового созревания вида (в возрасте 4+-7+) делают создание
маточного стада достаточно длительным и трудоемким процессом.
Существующие в настоящее время технологии управления воспроизводством
и половыми циклами этого вида не позволяют быстро получить половозрелых
производителей для целей искусственного разведения. Гистологическими ис-
следованиями показано, что даже в благоприятных условиях нагула и высоких
темпах соматического роста у муксуна происходит задержка гаметогенеза на
стадии цитологической дифференцировки пола и превителлогенеза [9], чему
причиной может являться гибридное происхождение этого вида [1].
В целом половое созревание, гаметогенез и половые циклы позвоночных
животных находятся под контролем многоуровневой эндокринной системы
гипоталамус — гипофиз — гонады. Центральная нервная система, интегрируя
комплекс внешних и внутренних сигналов, с помощью гипоталамических ре-
лизинг-гормонов воздействует на гипофиз; тот, в свою очередь, выделяет гона-
дотропные гормоны, активирующие синтез и выделение половых стероидных
гормонов секреторными клетками половых желез. На толстолобике

(Hypophthalmichthys molitrix) показано, что степень ответа гонадотропоцитов
гипофиза на стимуляцию различна между особями с более качественными по-
ловыми продуктами (т. е. более готовых к нересту) и менее качественными, что
обеспечивается изменением соотношения меро- и голокриновой секреции [6].
Воздействие гонадотропных гормонов (ГТГ) на секреторные клетки гонад так-
же зависит от множества факторов. Для активации стероидогенеза в клетках
Лейдига кроме гормонов гипофиза необходим эпидермальный фактор роста
Л. А. Шуман, Е. В. Ефремова, К. А. Дедуль
(ЭФР, EGF). Соединяясь с рецепторами в клетках Лейдига, ГТГ и ЭФР через
систему вторичных посредников (G-белки, цАМФ, протеинкиназы) активируют
транскрипционные факторы генов стероидогенеза [2]. Стероидные гормоны, в
свою очередь, воздействуют на множество органов и тканей, направляя про-
цессы полового созревания.
Кроме этого, основного сигнального пути на гаметогенез оказывают влияние
нонапептидные нейрогормоны (вазотоцин, изотоцин), которые могут выступать
антагонистами гонадотропных гормонов и иметь антигонадотропный эффект,
что необходимо для постнерестового торможения генеративного обмена [7].
Имеет значение также система соматотропный гормон — инсулиноподобный
фактор роста — инсулин, которая коррелирует с качеством половых продуктов
при овуляции у белого амура Ctenopharyngodon idella [5].
Различными исследованиями показано, что формирование гормонального
статуса, обеспечивающего в будущем регуляцию половых циклов и полового
поведения у рыб, происходит еще на относительно ранних стадиях онтогенеза,
задолго до морфологической дифференцировки внутривидовых группировок:
пестрятки и серебрянки атлантического лосося Salmo salar, пелагической и
анадромной группировки кумжи Salmo trutta labrax [13, 15]. Это наводит на
мысль о возможности управления процессами гаметогенеза рыб путем гормо-
нального воздействия на их молодь.
Кроме того, на гаметогенез и половые циклы напрямую могут влиять раз-
личные неблагоприятные факторы внешней среды, включая токсиканты, что для
муксуна в естественных условиях подтверждено рядом исследований [10-11, 17].
К настоящему времени для управления процессами воспроизводства и по-
ловыми циклами рыб уже давно и успешно применяется гормональное воздей-
ствие как в виде инъекций синтетических гормонов, так и в виде препаратов
гипофиза (гомогенатов или вытяжек), причем воздействие может быть оказано
на всех уровнях регуляции: гипоталамическими релизинг-гормонами, гонадо-
тропными гормонами и половыми стероидными гормонами. Для управления
связью гипоталамус — гипофиз широкое применение нашел синтетический
агонист гонадотропного релизинг-фактора — сурфагон (pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-
D-Ala-Leu-Arg-ProNHEt). Этот препарат в комбинации с другими веществами
(например, антагонистами дофамина) успешно используется для стимуляции
созревания ооцитов и овуляции у разных видов рыб: трехпятнистого дасцилла
Dascyllus Trimaculatus [8], осетровых [3-4], карасей Carassius auratus [20], кла-
риевого сома Clarias gariepinus [16] и др.
В то же время влияние инъекций сурфагона на неполовозрелую молодь рыб
исследовано гораздо меньше. В работе М. Клэр с соавторами [19] показано, что
комбинированное воздействие ГнРГ и тестостерона повышает уровень гонадо-
тропных гормонов в гипофизе и плазме крови и стимулирует начало вителло-
генеза (появление ооцитов фазы вакуолизации) у молоди полосатого окуня
(Morone saxatilis). Кроме того, известно, что сурфагон способен изменить рео-
реакцию молоди радужной форели, переведя ее в миграционное состояние [14].
Цель нашей работы состояла в изучении воздействия инъекций сурфагона
на гаметогенез и состояние внутренних органов молоди муксуна для определе-
ния возможности ускорения полового развития данного вида в искусственных
условиях.
Материал и методы
Эксперимент проводился на базе рыбоводных мощностей Собского рыбовод-
ного завода (пос. Харп, ЯНАО). Для исследования были отобраны 300 особей
сеголеток муксуна в возрасте 240 сут после вылупления. Рыбы были случайным
образом разделены на 3 группы по 100 ос. и рассажены в рыбоводные емкости
с идентичными температурными, гидрологическими и гидрохимическими ус-
ловиями (рис. 1). Средняя масса рыб составляла 53,5 г.
Двум группам были проведены инъекции сурфагона в объеме 0,02 и 0,05 мкг
на грамм веса особи. Контрольные и опытные группы подращивались в течение
семи месяцев. Постоянно отслеживали потребление корма, кормовые коэффи-
циенты, рост особей и отход. Проводили периодические гистологические фик-
сации особей в формалине, фиксаторах Бродского и Буэна (рис. 1).

Рис. 1. Схема эксперимента 

Для анализа возможных гистопатологий фиксировалии печень, почки, жабры,
кишечник, сердце. Для оценки темпа гаметогенеза фиксировалии гонады. Участ-
ки зафиксированных органов дегидратировали в спиртах возрастающей кон-
центрации и заливали в парафиновые блоки. Из блоков при помощи микротома
готовили срезы толщиной 5 мкм. Препараты окрашивали железным гематокси-
лином по Гейденгайну и заключали в среду Bio Mount (Bio Optica). Препараты
анализировали при увеличениях ×40, ×100, ×200, ×400 и ×1 000 на микроскопе
AxioImager A1 (Zeiss) и фотографировали видеокамерой AxioCam MRc5 с ис-
пользованием лицензионного программного обеспечения AxioVision 4.7.1.
Л. А. Шуман, Е. В. Ефремова, К. А. Дедуль
Изменения в гаметогенезе и половом созревании молоди муксуна ... 65
Экология и природопользование. 2018. Том 4. № 1
Препараты соматических органов анализировали на наличие гистопатологий,
характерных для каждой ткани. В гонадах оценивали фазы и стадии развития
половых клеток и их диаметр.
Для статистического анализа использовали программный пакет STATISTICA
Statsoft, Inc. (v. 6, 2006) и MS Excel (2007). Статистические различия в исследу-
емых параметрах рыб оценивали с использованием t-критерия Стьюдента и
непараметрического U-критерия Манна — Уитни.
Результаты и обсуждение
Рост и питание. Одними из простых, но эффективных параметров, позволяю-
щих оценить состояние популяции рыб, являются такие линейно-весовые по-
казатели, как соотношение «масса — длина», скорость роста и др. Между тем
существует некоторое противоречие между соматическим ростом и половым
созреванием особей. Общеизвестно, что после полового созревания ростовые
процессы в организме рыбы замедляются. В нашем исследовании за 7 мес.
средняя масса рыб и в контроле, и в опытных партиях возросла более чем в 2
раза, с 53 г в декабре до 120,5 г в июле, причем статистических различий
между группами не обнаружено.
Наиболее часто для оценки эффективности кормления в рыбоводной прак-
тике используют так называемый кормовой коэффициент — отношение затра-
ченного корма к приросту биомассы в стаде. В нашем исследовании кормовые
коэффициенты выращиваемых рыб были равны 1,2-1,3. Статистический анализ
не выявил достоверных различий в кормовых коэффициентах как между кон-
трольными и опытными вариантами, так и между самими опытными варианта-
ми, что доказывает отсутствие негативного влияния применяемого препарата
на эффективность потребления корма.
В целом можно сделать вывод, что при однократном гормональном воздей-
ствии на молодь муксуна процессы энергетического обмена и соматического
роста не претерпевают сколь либо существенных изменений.
Состояние соматических органов. Гистологический анализ печени, почек,
жабр и сердца не выявил существенных гистопатологий как в опытных группах,
так и в контрольной (рис. 2). Гепатоциты печени были умеренно базофильны,
в них присутствовали включения липидов (рис. 2А); печень в целом отличалась
значительной васкуляризацией, что свидетельствует об интенсивном функцио-
нировании этого органа. При анализе гистоморфологии почечной ткани и мио-
карда также не было установлено каких-либо отклонений (рис. 2Б, В). В жабрах
были отмечены незначительные аномалии в виде гиперплазии отдельных ре-
спираторных ламелл (рис. 2Г), однако они локализовались на незначительных
участках гистологического среза, и их количество статистически не различалось
в контрольной и опытных партиях.
Многочисленными исследованиями показано, что в естественных условиях
Обь-Иртышского бассейна в печени, почках и жабрах сиговых рыб постоянно
присутствуют различные гистопатологии [10, 11, 17, 18]. Это означает, что, во-
первых, условия среды в эксперименте были близки к оптимальным, а во-вторых,
использованные концентрации сурфагона не оказывают долгосрочного воздей-
ствия на внутренние органы.
Гаметогенез. В начале эксперимента гонады муксуна в возрасте 240 суток
находились на стадии анатомической дифференцировки пола (рис. 3А, Б). В
строме гонад располагались многочисленные гонии, клетки, перешедшие к
ранней профазе мейоза, практически отсутствовали.
В течение первого месяца после гормональных инъекций у самок, полу-
чивших дозу 0,05 мкг гормона на 1 г массы, начинался активный превителло-
генез, а к возрасту 267 сут в ооцитах этот период гаметогенеза завершался: в
цитоплазме превителлогенных ооцитов присутствовали липидные капли и по-
являлись единичные периферические вакуоли (рис. 3В, Г), что маркирует собой
самое начало фазы вакуолизации периода вителлогенеза (рис. 1).
У самок, получивших дозу 0,05 мкг гормона на 1 г массы, первые признаки
начала вителлогенеза в ооцитах появляются между возрастами 267 и 360 сут, а
в контрольной группе — только к возрасту 439 сут от вылупления (рис. 1), что
свидетельствует о дозозависимом ускорении процессов гаметогенеза при воз-
действии сурфагона на молодь муксуна.

Рис. 2. Состояние соматических органов
муксуна в эксперименте: А — печень;
Б — почки; В — миокард; Г — жабры

Рис. 3. Гаметогенез муксуна в
эксперименте: А — яичник муксуна в
начале эксперимента (возраст 240 сут,
контроль), индифферентный период
развития гонад; Б — то же на большем
увеличении, многочисленные клетки
стромы и оогонии; В — яичник особей
муксуна в возрасте 267 сут (опыт 0,05
мкг/г), многочисленные превителлогенные
ооциты; Г — то же на большем
увеличении, видны одиночные ооциты
начала фазы вакуолизации цитоплазмы;
Д — яичник муксуна в конце экспери-
мента (возраст 439 сут, опыт 0,02 мкг/г),
в гонаде имеются незрелые участки;
Е — яичник контрольных особей муксуна
в конце эксперимента (возраст 439 сут)
Однако к концу эксперимента степень развития яичников у контрольных
особей практически сравнялась с опытными группами (рис. 3Е). В строме го-
нады в большом количестве присутствовали превителлогенные ооциты, имелись
также ооциты начала фазы вакуолизации цитоплазмы. В это же время у особей
муксуна из первого варианта опыта (0,02 мкг/г) в яичниках появились аномалии
неравномерного развития (рис. 3Д): четко выделялись незрелые участки, в ко-
торых преобладали оогонии и ооциты ранней профазы мейоза, превителлоген-
ные ооциты же почти отсутствовали. Возможно, это связано с тем, что гормо-
нальный сдвиг, вызванный инъекцией низких концентраций сурфагона, недо-
статочен для модификации половых циклов муксуна. К концу эксперимента
волна гаметогенеза, запущенная инъекциями, «затухла», что привело к асин-
хронному развитию гонады и появлению незрелых участков.
Доля ооцитов старшей генерации во втором варианте опыта (0,05 мкг/г) на
протяжении всего эксперимента была достоверно выше, чем в контроле и в
первом варианте (таблица 1). В то же время средний диаметр ооцитов к концу
эксперимента у всех групп выровнялся, составив в среднем 90-95 мкм. Некото-
рое уменьшение среднего диаметра ооцитов в конце эксперимента, по сравнению
с первой фиксацией, связано не с уменьшением размеров клеток, а с формиро-
ванием большого количества новых генераций мелких превителлогенных
ооцитов.
Таблица 1
Цитологические характеристики гонад муксуна в эксперименте

Ядерно-цитоплазматическое отношение в ооцитах опытных групп вплоть
до середины эксперимента было достоверно ниже, чем в контроле, в то же вре-
мя статистически значимых различий по этому показателю между опытными
группами не выявлено. К концу эксперимента ядерно-цитоплазматическое от-
ношение в ооцитах контрольной группы сравнялось с таковым в опытных
группах (таблица 1).
Стоит отметить, что к концу эксперимента в ооцитах контрольной и опытных
партий отсутствовали желтковые гранулы, имелись только первые кортикальные
вакуоли и немногочисленные липидные капли, что свидетельствует о неготов-
ности организма к активному формированию нерестового фонда ооцитов. Даже
при ускорении гормонами гаметогенеза не происходит «переформатирования»
метаболизма с соматического роста на развитие генеративной ткани.
В целом можно сделать вывод, что инъекции сурфагона во время раннего
гаметогенеза муксуна способны значительно ускорить дифференцировку пола
и превителлогенез, значительно приблизить начало вителлогенеза, маркируемое
появлением вакуолизированных ооцитов. Однако эффект от применения гормо-
на склонен к затуханию во времени. Возможно, применение повторяющихся
(градуальных) инъекций в определенные этапы жизненного цикла позволит
значительно ускорить формирование маточных стад муксуна.
Как было указано выше, гормональная регуляция гаметогенеза зависит от
большого числа факторов как внутренних, так и внешних, поэтому для разра-
ботки эффективной системы управления половыми циклами муксуна в будущих
исследованиях необходимо учитывать гормональный фон в крови, состояние
гипофиза, процессы соматического роста и внешние сигнальные факторы (ги-
дрохимический режим, фотопериод, течение, обеспеченность пищей и др.).
Благодарности
Выражаем благодарность руководству (в лице Даниила Юрьевича Эльтекова) и
коллективу Собского рыбоводного завода за возможность проведения произ-
водственного эксперимента.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Балдина С. Н. Генетическая дифференциация муксуна Сoregonus muksun (Pallas)
и родственных видов сиговых рыб (Сoregonidae, Salmoniformes) Сибири по мтДНК
/ С. Н. Балдина, Н. Ю. Гордон, Д. В. Политов // Генетика. 2008. Т. 44. № 7.
С. 896-905.
2. Бахтюков А. А. Молекулярные механизмы регуляции стероидогенеза в клетках
Лейдига / А. А. Бахтюков, А. О. Шпаков // Цитология. 2016. Том 58. № 9.
С. 666-678.
3. Бубунец Э. В. Инновационная модель комбинированного стимулирования овуляции
у осетровых рыб и цитометрические особенности продуцируемых ооцитов /
Э. В. Бубунец, А. О. Ревякин, А. В. Лабенец // Биомедицина. 2014. Т. 1. № 4.
С. 65-69.
70
Вестник Тюменского государственного университета
4. Бубунец Э. В. Применение градуальныx инъекций сурфагона в нетрадиционные
сроки при воспроизводстве осетровых / Э. В. Бубунец, А. В. Лабенец // Аграрная
наука. 2012. № 2. С. 26-28.
5. Бурлаков А. Б. Вовлечение в регуляцию процессов созревания и овуляции ооцитов
соматотропного гормона у белого амура Ctenopharyngodon idella / А. Б. Бурлаков //
Вестник научных конференций. 2016. № 2-3 (6). С. 16-19.
6. Бурлаков А. Б. Особенности формирования в гонадотропоцитах гипофиза
овуляторной волны гонадотропина при искусственном воспроизводстве рыб с
высокой плодовитостью / А. Б. Бурлаков // Вестник Тюменского государственного
университета. Экология и природопользование. 2015. Том 1. № 1 (1). С. 126-132.
7. Гарлов П. Е. Разработка принципов эффективного управления биотехникой
воспроизводства рыб на основе нейроэндокринологических исследований /
П. Е. Гарлов // Известия Санкт-Петербургского государственного аграрного
университета. 2016. № 43. С. 153-160.
8. Емельянова Н. Г. Гормональная стимуляция созревания и овуляции, строение гамет
и выращивание личинок Dascyllus Trimaculatus (Pomacentridae) / Н. Г. Емельянова,
Д. А. Павлов, Л. Т. Б. Txyaн // Вопросы ихтиологии. 2009. Т. 49. № 2. С. 254-268.
9. Ефремова Е. В. Особенности дифференцировки пола и формирования фонда
половых клеток в раннем онтогенезе муксуна Coregonus Muksun (Pallas) /
Е. В. Ефремова, А. Г. Селюков, Л. А. Шуман // Вестник Тюменского
государственного университета. Экология и природопользование. 2011. № 6.
С. 46-55.
10. Исаков П. В. Сиговые рыбы в экосистеме Обской губы / П. В. Исаков,
А. Г. Селюков. Тюмень: Тюменский государственный университет, 2010. 184 с.
11. Исаков П. В. Состояние яичников и особенности овариальных циклов муксуна
Coregonus muksun (Coregonidae, Salmoniformes) в период зимовки в Обской губе /
П. В. Исаков, А. Г. Селюков // Вопр. ихтиологии. 2005. Т. 45. № 2. С. 242-250.
12. Литвиненко А. А. Современное состояние и проблемы восстановления запасов
сиговых рыб Обь-Иртышского бассейна / А. А. Литвиненко, Я. А. Капустина,
А. К. Матковский, С. М. Семенченко // Биология, биотехника разведения и
состояние запасов сиговых рыб. Тезисы Девятого Международного научно-
производственного совещания. Под общей редакцией А. И. Литвиненко,
Ю. С. Решетникова. Тюмень: Государственный научно-производственный центр
рыбного хозяйства, 2016. С. 57-60.
13. Нечаев И. В. Развитие этолого-физиологической дифференциации между
пестрятками и серебрянками атлантического лосося Salmo salar / И. В. Нечаев,
Д. С. Павлов, В. Я. Никандров // Вопросы ихтиологии. 2007. Т. 47. № 6. С. 799-818.
14. Павлов Д. С. Реореакция молоди радужной форели при воздействии сурфагона /
Д. С. Павлов, Е. Д. Павлов, В. В. Костин, Е. В. Ганжа // Онтогенез. 2016. Т. 47. № 2.
С. 110-116.
15. Павлов Д. С. Содержание тиреоидных и половых стероидных гормонов у сеголеток
черноморской кумжи Salmo trutta labrax из двух пространственных группировок
при разной продолжительности голодания / Д. С. Павлов, Е. Д. Павлов, Е. В. Ганжа,
В. В. Костин // Известия ран. Серия «Биологическая». 2015. № 4. С. 415-422.
16. Романова Е. М. Инновационные подходы в получении половых продуктов
африканского клариевого сома в бассейновой аквакультуре / Е. М. Романова,
Л. А. Шуман, Е. В. Ефремова, К. А. Дедуль
Изменения в гаметогенезе и половом созревании молоди муксуна ... 71
Экология и природопользование. 2018. Том 4. № 1
В. Н. Любомирова, В. В. Романов, М. Э. Мухитова // Вестник Ульяновской
государственной сельскохозяйственной академии. 2017. № 3 (39). С. 88.
17. Селюков А. Г. Репродуктивная система сиговых рыб (Coregonidae, Salmoniformes)
как индикатор состояния экосистемы Оби. II. Половые циклы муксуна Coregonus
muksun // Вопр. ихтиологии. 2002 б. Т. 42. № 2. C. 225-235.
18. Шуман Л. А. Гистопатологические изменения и репродукционный потенциал у рыб
в водоемах Обь-Иртышского бассейна с различной антропогенной нагрузкой: дисс.
… канд. биол. наук // Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного
хозяйства и океанографии. Москва. 2014. 203 с.
19. Claire M. Effects of Long-Term Testosterone, Gonadotropin-Releasing Hormone
Agonist, and Pimozide Treatments on Gonadotropin II Levels and Ovarian Development
in Juvenile Female Striped Bass (Morone saxatilis) / M. Claire, H. Holland, S. Hassin,
Y. Zohar // BIOLOGY OF REPRODUCTION 59. 1998. Pp. 1153-1162.
20. Targonґska K. The Application of hCG, CPH and Ovopel in Successful Artificial
Reproduction of Goldfish (Carassius auratus auratus) Under Controlled Conditions /
K. Targonґska, D. Kucharczyk // Reprod Dom Anim. 2011. № 46. Pp. 651-655.

Шуман Л. А. Изменения в гаметогенезе и половом созревании молоди
муксуна (Coregonus muksun) при воздействии сурфагона / Л. А. Шуман, Е. В. Ефремова,
К. А. Дедуль // Вестник Тюменского государственного университета. Экология и при-
родопользование. 2018. Том 4. № 1. С. 61-75.