3.2. Оценка межвидовых отношений сиговых рыб по цитометрическим показателям ППК в эмбриональный период

Рассмотрим межвидовые отношения типичных для Обь-Иртышского бассейна сиговых рыб с использованием методов многомерной статистики (дискриминантный и кластерный анализы) основных цитометрических показателей первичных гоноцитов эмбрионов в начальный период формирования репродуктивной системы [Ефремова, 2013].

Рассмотрим результаты дискриминантного анализа, проведенного по 5 цитометрическим показателям с учетом всех переменных (табл. 1).
Поскольку λ Уилкса принимает значения от 0 (идеальное разделение) до 1 (разделение отсутствует), а частная λ Уилкса связана с единичным вкладом переменной в разделительную силу модели [Боровиков, 2003], ведущее значение в разделении видов имеет количество ядрышек в первичных гоноцитах (Nnl). Второе по значению вклада место принадлежит диаметру ядра (Dn), третье — числу одиночно лежащих ППК (Nc); последующие по значимости в разделении видов показатели: количество ППК в синцитиях (Ncs) и диаметр первичных гоноцитов (Dc). Анализируя линейный коэффициент детерминации, можно отметить слабую связь между видами в эмбриональный период (табл. 1). Все исследуемые переменные обладают низкой избыточностью, но наименьшей — число ядрышек, что свидетельствует о независимости данного показателя от всех остальных. Можно видеть (рис. 10), что по первой дискриминантной функции (координата 1) все виды подразделяются на 3 группы: в первую входит муксун, который отчетливо обособлен от других видов, во вторую –пыжьян, пелядь и тугун, в третьей находится чир. По второй дискриминантной функции (координата 2) дискриминация между группами выражена слабее.

Пыжьян как по первой, так и по второй координатам занимает промежуточное положение, а такие виды как тугун и пелядь слабо различаются по обеим дискриминантным функциям. В данном случае квадрат дистанции Махаланобиса позволяет ранжировать виды по расстоянию между ними в следующем порядке: пелядь→тугун→ пыжьян→чир→муксун (табл. 2).

Таблица 1. Общая оценка качества дискриминантного анализа для пяти видов
сиговых рыб по 5 цитометрическим показателям. Критерий λ Уилкса:0,03768;
F-критерий: (20,97) = 8,1945; p<0,00001

Таблица 2. Оценка расстояний между классами (виды сиговых рыб) в полном дискриминантном анализе

Примечание: над диагональю значения F-критерия при различении классов, под диагональю — квадрат дистанции Махаланобиса.

Рис. 10. Положение классов эмбрионов сиговых рыб в координатах
полного дискриминантного анализа:
° Coregonus muksun □ Coregonus nasus ▲ Coregonus lavaretus pidschian
◊ Coregonus peled • Coregonus tugun

 

 

Если брать за точку отсчета параметры ППК муксуна, то этот вид наиболее близок к пыжьяну, далее следует тугун, а чир и пелядь отстоят на максимальной дистанции. Расстояние по данным параметрам первичных гоноцитов между тугуном и пыжьяном наименьшее. Если из суммы признаков вычленить количество ППК в синцитиальных комплексах (рис. 11), по которым, как показано ранее, виды существенно разделяются, то в целом взаиморасположение эмбриона каждого вида на диаграмме практически не изменяется. Это свидетельствует о низкой значимости данного показателя в период эмбриогенеза.
Проведенный анализ коэффициента детерминации показал столь же низкий уровень (табл. 3), как и с включением в переменные количества ППК в составе синцитиев; наибольшим весом и в этом варианте отличалось число ядрышек (Nnl), распределение видов также не изменяется: пелядь→тугун→ пыжьян→чир→муксун (табл. 4).
Для выяснения степени значимости для разделения видов такого параметра как количество ядрышек в первичных гоноцитах, данный показатель был выведен из суммы признаков, после чего наиболее весомым параметром стал размер ядра ППК (табл. 5). В результате муксун оказался еще более обособленным от остальных сиговых (рис. 12), тогда как бентофаг чир «объединился» с планктофагом-тугуном, поменявшись местами с планктофагом-пелядью.

Таблица 3. Общая оценка качества дискриминантного анализа для пяти видов сиговых рыб по 4 цитометрическим показателям.
Критерий λ Уилкса: 0,05740; F–критерий: (16,92) = 8,9302; p <0,00001

Таблица 4. Оценка расстояний между классами (эмбрионы сиговых рыб) в полном дискриминантном анализе

Рис. 11. Положение классов эмбрионов сиговых рыб в координатах
полного дискриминантного анализа (без учета синцитиев):
° Coregonus muksun □ Coregonus nasus ▲ Coregonus lavaretus pidschian
◊ Coregonus peled • Coregonus tugun

Для выяснения степени значимости для разделения видов такого параметра как количество ядрышек в первичных гоноцитах, данный показатель был выведен из суммы признаков, после чего наиболее весомым параметром стал размер ядра ППК (табл. 5). В результате муксун оказался еще более обособленным от остальных сиговых (рис. 12), тогда как бентофаг чир «объединился» с планктофагом-тугуном, поменявшись местами с планктофагом-пелядью.

Таблица 5. Общая оценка качества дискриминантного анализа по цитометрическим
показателям ППК (с исключением ядрышек) у эмбрионов сиговых рыб.
Критерий λ Уилкса: 0,09705 approx. F (16,92) = 6,6089; p <0,00001

Рис. 12. Положение классов эмбрионов сиговых рыб в координатах полного дискриминантного

Использование квадрата дистанции Махаланобиса для ранжирования видов по расстоянию между ними (табл. 6) продемонстрировало неприемлемость с точки зрения современных представлений о филогении сиговых рыб [Решетников, 2010] полученной диспозиции (чир→тугун→ пыжьян→пелядь→муксун).

Таблица 6. Оценка расстояний между классами (видами сиговых рыб) в полном дискриминантном анализе

Приведённые результаты отчетливо показали необходимость учета при оценке межвидовых отношений по репродуктивным показателям такого параметра как количество ядрышек в первичных половых клетках.

Таким образом, можно считать, что именно число ядрышек первичных гоноцитов является наиболее значимым признаком для выявления межвидовых различий сиговых рыб в эмбриональный период. Принятая ранее рабочая гипотеза относительно важности при видовой характеристике количества ППК в составе синцитиев, достаточно отчетливо выделяющих первичные гоноциты некоторых видов и как-будто разделяющие их, не может иметь существенного значения и, очевиднее всего, отражают уровень активности специфической пролиферации, свойственной этим клеткам у всех эмбрионов.
Дискриминантный анализ с использованием цитометрических показателей ППК (рис. 13), проведенный на этапе вылупления, продемонстрировал отчетливое разделение тугуна и остальных видов.
Пелядь, муксун, чир и пыжьян на данном этапе концентрируются вблизи центра, изменяя при этом свое местоположение, по сравнению с периодом эмбриогенеза, что отражает изменение степени развития цитометрических параметров их ППК (табл. 2, 5 Приложения). Можно видеть, что предличинки пыжьяна по первой дискриминантой функции (координата 1) занимают в группе центральное положение, как и в эмбриональный период, тогда как по второй (координата 2) в центре локализуется чир. Различия между видами снижаются, и наибольший вклад в их разделение вносит диаметр ядра, за которым следует диаметр клетки, тогда как количество ядрышек смещено на третье место (табл. 7). На данном этапе раннего онтогенеза расстояние между отдельными видами и их ранжирование существенно отличается от эмбрионального периода.

Таблица 7. Общая оценка качества дискриминантного анализа
по цитометрическим показателям ППК у сиговых рыб на этапе вылупления.
Критерий λ Уилкса: 0,02653 approx. F (20,113) = 11,299; p <0,00001

Рис. 13. Положение классов предличинок сиговых рыб на этапе вылупления в координатах полного дискриминантного анализа

Квадрат дистанции Махаланобиса позволяет распределять виды по расстоянию друг от друга: чир→муксун→ пыжьян→пелядь→тугун (табл. 8). Но если оценивать межвидовые связи, взяв за точку отсчета показатели ППК пеляди, то между этим видом и тугуном оказываются сиги бентофаги, что сомнительно в отношении их таксономического положения.
Проведенный дискриминантный анализ с выводом из состава переменных признака «число клеток в синцитиях», как можно видеть (рис. 14), и на этапе вылупления совершенно не изменил диспозиции.

Таблица 8. Оценка расстояний между классами в полном дискриминантном анализе у сиговых рыб на этапе вылупления

Рис. 14. Положение классов сиговых рыб
на этапе вылупления в координатах полного дискриминантного анализа (без учета синцитиев)

Рис. 15. Положение классов сиговых рыб
на этапе вылупления в координатах полного дискриминантного анализа (исключая тугуна)

Однако после исключения тугуна, оставшиеся виды перераспределились: чир остается в центре как по 1, так и по 2 координатам, пелядь смещается к периферии, а пыжьян отличается широким разбросом вариант (рис. 15). Исключение из анализа также числа синцитиев (рис. 16) не изменило расположения видов, что и в данном случае подтверждает отсутствие значимости этого показателя при оценке их таксономического положения.
Сопоставление полученного соотношения с результатами дискриминантного анализа (по данным 1987 г. с разницей в 4–5 поколений) показало значительное отделение с минимальным внутригрупповым разбросом сига-планктофага — пеляди, занявшего на диаграмме место тугуна, от муксуна, чира и пыжьяна (рис. 17), что может свидетельствовать об отчетливых внутриродовых различиях по цитометрическим параметрам ППК сиговых рыб.

 

Как и прежде, наибольший вклад в разделение видов вносит количество ядрышек (Nnl), второе по значению место принадлежит диаметру клетки (Dc), третье занимает диаметр ядра (Dn) (табл. 9). Согласно квадрату дистанции Махаланобиса, пелядь отстоит от «ближайшего соседа» (пыжьяна, чира и муксуна) почти на равное расстояние (20,3–21,3), что кратно превышает расстояние между видами сигов бентофагов (0,8–6,6) (табл. 10).

Таблица 9. Общая оценка качества дискриминантного анализа по цитометрическим показателям ППК у сиговых рыб на этапе вылупления (1987г.).
Критерий λ Уилкса: 0,10583 approx. F (12,129) = 14,477; p <0,0000

Таблица 10. Оценка расстояний между видами в полном дискриминантном анализе сиговых рыб на этапе вылупления (1987г.)

Рис.16. Положение классов сиговых рыб при вылуплении в координатах полного дискриминантного анализа
(без учета тугуна и синцитиев)

Рис. 17. Положение классов сиговых рыб при вылуплении в координатах полного дискриминантного анализа (1987 г.)

Исключение в этот период раннего онтогенеза из состава цитометрических показателей числа ядрышек в ППК продемонстрировало полное смешение видов (рис. 18), что лишь подтверждает важность этого параметра. Приведенные же табличные данные свидетельствуют о низких значениях оставшихся показателей для межвидовой дифференциации (табл. 11). При установлении соотношения между видами также можно видеть (табл. 12) неприемлемое, с позиций современной классификации [Решетников, 2010, 2013], межвидовое соотношение: наименьшее расстояние между пелядью и муксуном (0,3), пелядью и чиром (0,4), и наибольшее — между бентофагами пыжьяном и чиром (4,2), пыжьяном и муксуном (6,0).

Таблица 11. Общая оценка качества дискриминантного анализа для четырех видов сиговых рыб по 3 цитометрическим показателям.
Критерий λ Уилкса: 0,46559; F-критерий: (9,12) = 4,9958; p <0,0000

Рис. 18. Положение классов сиговых рыб при вылуплении в координатах полного дискриминантного анализа
(без учета ядрышек, 1987г.)

Таким образом, проведенный дискриминантный анализ позволил отчетливо разделить сиговых рыб р.Coregonus в эмбриональный период и выделить три параметра ППК, в значительной степени отражающих различия этих видов не только в период эмбриогенеза, но и на этапе вылупления: количество ядрышек, диаметр ядер и диаметр клеток. При этом наиболее значимым признаком в их разделении является число ядрышек.
Здесь можно задаться вопросом, почему именно количество ядрышек ППК является наиболее значимым показателем при оценке межвидовых отношений в эмбриогенезе исследуемых видов. Более подробно на этом остановимся далее, при оценке ядрышка в реакции на интоксикацию. Здесь отметим, что ядрышки являются фенотипическим выражением активности ядрышкообразующих локусов хромосом; показано [Архипчук и др., 1993], что суммарный показатель ядрышковой активности характеризуется высокой степенью наследуемости. Количественные характеристики ядрышек отражают их роль в транскрипции рибосомных генов (рДНК), созревании первичных транскриптов 47–45S пре-рРНК и сборке прерибосомных частиц. Ядрышки являются одним из важнейших актов генной экспрессии в процессе становления герминативной стволовой клетки — ППК. Об этом же свидетельствуют многочисленные исследования [Чмилевский, 1971; Каменева, 1991; Чмилевский, Каменева, 2001 а и др.].
Полученные с применением дискриминантного анализа данные о соотношении видов сиговых рыб на двух ответственных этапах раннего онтогенеза — пигментации глаз и начала формирования желточной сети кровеносных сосудов в эмбриогенезе и вылупления — позволяют считать, что эмбриональный период для видовой дифференциации по цитометрическим параметрам ППК достаточно информативен.
Для установления степени связи параметров ППК у эмбрионов изученных видов был проведен кластерный анализ [Ефремова, 2013]. Автором показано, что у эмбрионов муксуна на стадии пигментации глаз связь между числом синцитиев, размерами ядер и клеток слабая и недостоверная, а между числом клеток и ядрышек — отсутствует. Напротив, у чира отмечена высокая корреляция (0,72) числа клеток в синцитиях и количества одиночных ППК, и средняя (0,65) — между размерами первичных гоноцитов и их ядер. У пыжьяна выявлена наибольшая корреляция между числом одиночных ППК и числом клеток в синцитиальных образованиях (0,82), а между числом ядрышек и диаметром ППК — слабая. У планктофага пеляди установлена тесная связь (0,85) между размерами ППК и ядер, средняя — между числом клеток и ядрышек (0,66), тогда как между этими параметрами и числом синцитиев корреляция очень слабая и отрицательная. Отметим, что у этого вида количество синцитиев — наименьшее среди всех сиговых. Зато у тугуна, число синцитиев столь же велико, как у муксуна, характер связи между исследуемыми признаками также напоминает их связь у данного вида.
Корреляция между морфологическими показателями у сиговых рыб на этапе вылупления низкая [Селюков и др., 2005: Беспоместных, 2007], реже — средняя; и только связь абсолютной длины тела с антеанальным расстоянием у всех видов сильная, а у тугуна и муксуна высокая корреляция отмечена и по числу меланофоров: mfv-mfs (тугун), mfc-mfd и mfv-mfs (муксун). Проведенный нами кластерный анализ связи цитометрических параметров ППК у предличинок сиговых рыб на этапе вылупления, по аналогии с периодом эмбриогенеза, выявил ряд особенностей.
У предличинок муксуна размеры первичных гоноцитов и диаметр ядер были высоко скоррелированы между собой (r >0,9). Связь по остальным параметрам была слабой или отсутствовала, а число ядрышек находилось в слабой обратной связи с остальными показателями (r <– 0,12). У чира корреляция признаков проявлялась в тесной связи размеров клеток и ядер (r >0,9), с которыми также высоко коррелировало число ядрышек (0,7). При этом связь между числом одиночных клеток и клеток в составе синцитиев также была высокой (0,8), но с остальными параметрами находилась в столь же тесной, но обратной зависимости (– 0,77). У пыжьяна наиболее тесная связь отмечена между числом одиночных ППК и половых клеток

Таблица 12. Оценка расстояний между видами в полном дискриминантном анализе у сиговых рыб на этапе вылупления (1987 г.)

в составе синцитиев (0,83), тогда как между остальными параметрами первичных гоноцитов она была слабой или отрицательной.
У предличинок пеляди установлена высокая связь размеров первичных гоноцитов и их ядер (0,88), также высокая корреляция (0,72) отмечена между числом ядрышек и количеством одиночных клеток. Однако число ППК в синцитиальных образованиях находилось в слабой обратной связи с остальными параметрами (– 0,17). Сходным образом размеры первичных гоноцитов и их ядер у тугуна высокоскоррелированы (0,98), но корреляция с числом ядрышек слабая (0,48).
Таким образом, на этапе вылупления у разных видов сиговых рыб связь цитометрических показателей первичных гоноцитов изменяется от очень слабой до тесной прямой и обратной. При этом параметры могут группироваться в кластеры — размеры клеток, ядер, число ядрышек, а также число одиночных и объединенных в синцитии ППК — и отличаться высокой связью (чир). В пределах вида связи между параметрами могут варьировать от высоких положительных до слабых и отрицательных (пыжьян, отчасти пелядь и муксун).
Прежде, чем перейти к следующему периоду онтогенеза — постэмбриональному развитию, — проследим реакцию формирующейся репродуктивной системы в эмбриональный период сиговых рыб на некоторые факторы природного и антропогенного происхождения — температуру и загрязнение.